使用IPP测定生物发光的光密度

丁香园 hbchendl 网友提供的非常优秀的Image-Pro Plus(IPP)动画教程的这一章节找不到了(也许根本就没有这一段,是我记错了)。于是就自己摸索,折腾出这个办法,有些笨。留在这儿备查。有兴趣的朋友欢迎交流。

适用:基于化学发光原理的条带(如Western)和芯片(如抗体芯片)分析,当然PCR的电泳条带也可以。

1. 软件设置:Measure – Calibration - Intensity,New一个新的,选择Std. Optical Density,点击System按钮,设置为系统默认。简单说,就是点越黑,数值越高。Close关闭窗口。
clip_image002

2. 选择需要测量的指标,包括面积和光密度:Measure - Count/Size,在弹出窗口Count / Size中选择Measure - Select Measurements,加入Area(默认已经添加)和IOD(“综合光密度”,包括了面积和光强度信息),OK关闭窗口;关闭Count / Size窗口。
clip_image004

3. 打开图片,使用工具栏的方框、圆形或者不规则图标圈取感兴趣的区域(ROI),这里用圆形框选一个。注意不要把整个点覆盖到。为什么这样,不多解释。
clip_image006

4. 点击工具栏Count and measure objectsclip_image008图标,再次弹出Count / Size窗口,点击“Select Range…”按钮,弹出Segmentation窗口,将测量范围选择所有(两条红色竖线分别置于0和65535两个顶端),此时图片应该全部被红色覆盖(Class color)。Close关闭窗口。
clip_image010

5. 回到Count / Size窗口,点击Count按钮计数,此时在ROI内会有1(测量的区域数目)并且标志红色框(测量区域)。菜单View – Statistics,获得Sum一栏的Area和IOD值,记下来(有能力可以Export Data到Excel文档,这里不详述)。

6. 测量另一个同等大小ROI的灰度值:关闭Statistics窗口,将ROI鼠标点击移动到另一个区域(鼠标指针变为十字形时,按下左键拖动到另一个区域,放下鼠标左键即可,1和红色框还留在原处,不需要管它),再次点击Count,然后View – Statistics,读取这个区域的Area和IOD的Sum值。如果保持ROI大小不变,Area值应该都一样大。

7. 每个ROI的平均光密度计算:IOD/Area。